FDA注冊號：
3010704506
臺式離心機進行腎單層細胞培養的操作過程
發布時間：
2015-07-08
概要：
將分散的細胞經2—3層消毒紗布過濾，取濾液置于臺式離心機中以1500轉/分離心十分鐘，棄去上清液，加適昆乳漢液混勻，再次通過臺式離心機離心，最后加入乳漢液使細胞懸浮其中，收集于滅菌三角瓶中。
組織培養的方法很多，大體分為懸浮培養和固定培養兩類。懸浮培養是將切碎的組織塊通過臺式離心機進行離心分離，然后將通過臺式離心機分離出來的分散的細胞放在適當的培養液中，讓其浮游于液體小進行培養，然后接種病毒。
另外還有固定培養法是使組織塊通過臺式離心機分散的細胞粘附與容器壁上進行培養，待細胞生長良好后接種病毒。病毒在組織培養細胞中繁殖的主要標志是細胞病變(壞死、崩解、脫落等)，細胞融合或形成包涵體，對紅細胞的吸附作用等。
下面簡單介紹通過臺式離心機進行“腎單層細胞培養”的一般操作技術。
1．取腎：用無菌操作取出斷乳前后幼齡動物的腎臟置滅菌平皿中，剪去留的被膜和脂肪，并縱向切成兩半，剪去腎的被膜和脂肪，并縱向切成兩半，剪去腎盂及髓質部分，用含雙抗(指青、鏈霉素，下同)的漢克氏液洗凈，移置小燒杯中，剪成乳糜狀，再用漢克氏液洗2—3次，至液體澄清無血細胞為止。
2．消化；加入10倍的0.125％胰酶液進行消化。有熱消化法(在37℃水浴中)和冷消化法(在4℃冰箱中)兩種。消化的時間根據不同的組織細胞和所用胰酶的活性而定，直至聚成絮狀的腎組織又分散開。取出傾去胰酶，用漢克氏液洗滌數次，然后加入少量乳漢液，用吸管進行吹打(即吸入和吹出)10-20次，使組織分散為細胞。將分散的細胞經2—3層消毒紗布過濾，取濾液置于臺式離心機中以1500轉/分離心十分鐘，棄去上清液，加適昆乳漢液混勻，再次通過臺式離心機離心，最后加入乳漢液使細胞懸浮其中，收集于滅菌三角瓶中。
3．細胞計數和分裝：取已制好的細胞懸浮液，用計數白細胞的方法計數，根據計數結果，用營養液(pH6.8—7.0)稀釋為每毫升含50-60萬細胞，分裝于小扁瓶中(容量約50毫升的扁瓶加懸液約5毫升)，也可分裝在鏈霉素小瓶中。
4．培養：在37℃培養，3—4天即可粘附瓶壁形成單層細胞，以后每過3—4大更換一次維持液。
5．接毒；將病料剪碎，按1：4加含雙抗的漢克氏液研磨成乳糜狀，經凍融處理使細胞破碎，病毒充分釋放，用臺式離心機，將轉速控制在3000轉/分左右離心15分鐘，將上清液接種到已生長單層細胞的培養瓶中，在37℃溫箱中吸附30-60分鐘，然后加入維持液繼續培養。
6．收獲病毒：每日或隔日用低倍顯微鏡觀察細胞病變情況，當有50-75％細胞出現病變隊時可收集培養瓶中液體，從放在冰箱(-20℃)中保存，此即繁殖的病毒液。
7．注意事項：培養皿及其他使用器具的潔凈、臺式離心機的使用、水的質量、酸堿度、無菌操作等，都是關系到組織培養成敗的重要問題，必須嚴格規定的要求去做。
另外還有固定培養法是使組織塊通過臺式離心機分散的細胞粘附與容器壁上進行培養，待細胞生長良好后接種病毒。病毒在組織培養細胞中繁殖的主要標志是細胞病變(壞死、崩解、脫落等)，細胞融合或形成包涵體，對紅細胞的吸附作用等。
下面簡單介紹通過臺式離心機進行“腎單層細胞培養”的一般操作技術。
1．取腎：用無菌操作取出斷乳前后幼齡動物的腎臟置滅菌平皿中，剪去留的被膜和脂肪，并縱向切成兩半，剪去腎的被膜和脂肪，并縱向切成兩半，剪去腎盂及髓質部分，用含雙抗(指青、鏈霉素，下同)的漢克氏液洗凈，移置小燒杯中，剪成乳糜狀，再用漢克氏液洗2—3次，至液體澄清無血細胞為止。
2．消化；加入10倍的0.125％胰酶液進行消化。有熱消化法(在37℃水浴中)和冷消化法(在4℃冰箱中)兩種。消化的時間根據不同的組織細胞和所用胰酶的活性而定，直至聚成絮狀的腎組織又分散開。取出傾去胰酶，用漢克氏液洗滌數次，然后加入少量乳漢液，用吸管進行吹打(即吸入和吹出)10-20次，使組織分散為細胞。將分散的細胞經2—3層消毒紗布過濾，取濾液置于臺式離心機中以1500轉/分離心十分鐘，棄去上清液，加適昆乳漢液混勻，再次通過臺式離心機離心，最后加入乳漢液使細胞懸浮其中，收集于滅菌三角瓶中。
3．細胞計數和分裝：取已制好的細胞懸浮液，用計數白細胞的方法計數，根據計數結果，用營養液(pH6.8—7.0)稀釋為每毫升含50-60萬細胞，分裝于小扁瓶中(容量約50毫升的扁瓶加懸液約5毫升)，也可分裝在鏈霉素小瓶中。
4．培養：在37℃培養，3—4天即可粘附瓶壁形成單層細胞，以后每過3—4大更換一次維持液。
5．接毒；將病料剪碎，按1：4加含雙抗的漢克氏液研磨成乳糜狀，經凍融處理使細胞破碎，病毒充分釋放，用臺式離心機，將轉速控制在3000轉/分左右離心15分鐘，將上清液接種到已生長單層細胞的培養瓶中，在37℃溫箱中吸附30-60分鐘，然后加入維持液繼續培養。
6．收獲病毒：每日或隔日用低倍顯微鏡觀察細胞病變情況，當有50-75％細胞出現病變隊時可收集培養瓶中液體，從放在冰箱(-20℃)中保存，此即繁殖的病毒液。
7．注意事項：培養皿及其他使用器具的潔凈、臺式離心機的使用、水的質量、酸堿度、無菌操作等，都是關系到組織培養成敗的重要問題，必須嚴格規定的要求去做。
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