低速離心機(jī)分離紅細(xì)胞的技術(shù)

發(fā)布時(shí)間：

2011-12-28

概要：

以水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2 000r/min離心20min。離心后，可見分成多層，最下層是紅細(xì)胞，中間層是分層液，最上層是血漿。在血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個(gè)核細(xì)胞層。

材料與試劑

1．肝素等抗凝劑 2．3％明膠液取明膠3g，溶于0.9％滅菌鹽水100ml中，114.3℃滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存。臨用時(shí)，37℃預(yù)熱10min。 3．阿氏液

（二）操作方法

1．采血抗凝，即為紅細(xì)胞。由于紅細(xì)胞與白細(xì)胞的比例相差懸殊，一般白細(xì)胞混雜在其中，忽略不計(jì)。

2．根據(jù)紅細(xì)胞的用途，可做進(jìn)一步的處理。如計(jì)算紅細(xì)胞，可直接稀釋計(jì)。如需做補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)，或其它溶紅細(xì)胞反應(yīng)，則需將紅細(xì)胞進(jìn)行充分的清洗，以除去附著在紅細(xì)胞膜表面的血漿。一般用等滲的稀釋液連續(xù)清洗，2 000r/min離心10min，重復(fù)3~4次。

3．如需儲藏備用，則以阿氏液做抗凝劑采血，混勻后置4℃冰箱保存，可保存2周，其活性尚可。

淋巴細(xì)胞的分離技術(shù)

（一）材料與試劑

1．淋巴細(xì)胞分層液有兩種：

（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。應(yīng)用時(shí)，用蒸餾水配制9％溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，結(jié)構(gòu)式為3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量為60％或75％，每安瓶為20ml裝，常用于人的臟器造影。應(yīng)用時(shí)，取60％泛影葡胺原液20ml，加雙蒸餾水15.38ml，即為33.9％泛影葡胺。 1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制： 9％聚蔗糖液 24份 33.9％泛影葡胺液 10份混合即可。必要時(shí)，可測比重。需要備用，可用G5漏斗過濾除菌或114.3℃高壓滅菌15min，4℃保存。一般可保存3月。如要配制不同比例的分層液，可按下列公式計(jì)算：式中dm為分層液的比重，d1和d2分別為9％聚蔗糖和33.9％泛影葡胺的比重，V1和V2分別為它們的體積。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分層液，則9％的聚蔗糖和33.9％的泛影葡胺的比例應(yīng)為100︰46.3。

（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液 34％泛影葡胺液 10份 60％右旋糖酐液 12.5份混合，即為比重1.07～1.09的分層液。分裝于棕色瓶中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2． 3％的明膠液稱取明膠3g，溶于0.9％的滅菌生理鹽水，終體積100ml，114.3℃高壓滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存，臨用時(shí)37℃預(yù)熱10min。 3．Hank’s液。

（二）操作方法

1．取抗凝血，自然沉降，如是馬屬動物的血液，可直接直立試管架上，讓其自然沉降1h，取上層血漿。如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明膠液，混勻后讓其自然沉降，1h后取上層血漿。

2．2 000r/min離心10min，棄上清。

3．沉淀用Hank’s液混懸后，再2 000r/min離心10min。

4．重復(fù)步驟3一次，再用細(xì)胞營養(yǎng)液將白細(xì)胞制成懸液。此液含有整個(gè)白細(xì)胞群，包括粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和部分紅細(xì)胞。可供白細(xì)胞計(jì)數(shù)用。

5．取2ml細(xì)胞分層液于離心管內(nèi)，同時(shí)用毛細(xì)吸管吸取約2ml的血漿（自然沉降1h的上層血漿）輕輕加入分層液上，直接加抗凝血也可。

6．以水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2 000r/min離心20min。離心后，可見分成多層，最下層是紅細(xì)胞，中間層是分層液，最上層是血漿。在血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個(gè)核細(xì)胞層。

7．用毛細(xì)吸管插入到單個(gè)核細(xì)胞層并吸取該層，放入另一試管中。

8．以Hank’s液洗滌、離心，最后配制成適當(dāng)?shù)陌准?xì)胞濃度。必要時(shí)可計(jì)數(shù)。

（三）注意事項(xiàng)

1．血漿或血液加入分層液中時(shí)要小心，緩慢不要打亂液層、不要搖動。也可以將分層液加入到血漿的上層。

2．保持淋巴細(xì)胞的活性是非常重要的，所以一般情況下，是現(xiàn)采血，馬上進(jìn)行分離。

3．經(jīng)過分層液分離的淋巴細(xì)胞層，實(shí)際上是單個(gè)核細(xì)胞層，包括單核細(xì)胞，不包括粒細(xì)胞。欲分離出純的淋巴細(xì)胞，則按下法除去單核細(xì)胞，或收獲單核細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：

離心機(jī)分離生物T淋巴細(xì)胞的技術(shù)

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